清華新聞網7月8日電 蛋白質定向進化是生物技術領域的重要工具，通過模擬自然進化過程，在實驗室中快速優化蛋白質功能。然而，傳統方法如易錯PCR存在耗時長、效率低、突變庫多樣性受限等問題。近年來，基于CRISPR-Cas或T7RNA聚合酶的突變系統雖然取得進展，但仍面臨突變范圍小、宿主普適性窄等挑戰。在非模式生物（如嗜鹽單胞菌Halomonas blue phagenesis）中，缺乏高效的蛋白質定向進化工具，限制了其在工業生物技術中的應用。如何開發一種高效、高特異性、廣宿主兼容且能同時引入多種突變類型的系統，成為亟待解決的難題。
7月1日，清華大學生命學院陳國強教授團隊在《自然·通訊》（Nature Communications）發表題為“一種產生全部轉換突變的正交轉錄突變系統用于體內加速蛋白質進化”（An orthogonal transcription mutation system generating all transition mutations for accelerated protein evolutionin vivo）的研究論文，報道了一種正交轉錄突變系統（OTM）。該系統通過將三種廣宿主兼容性的噬菌體RNA聚合酶（MmP1/K1F/VP4）與兩種脫氨酶（PmCDA1和TadA變體）巧妙融合，構建了一個高效、模塊化的蛋白質進化平臺。其設計原理在于，RNA聚合酶在轉錄過程中解旋DNA形成單鏈區，而融合的脫氨酶則能對暴露的單鏈DNA進行編輯，實現C:G-T:A和A:T-G:C類型的堿基突變。該系統能在短短一天內完成蛋白質的定向進化，突變效率較自發突變提升150萬倍。
研究中，研究人員采用XTEN柔性連接肽分別將胞嘧啶脫氨酶和腺嘌呤脫氨酶與噬菌體RNA聚合酶融合，構建了分別能夠產生C:G-T:A和A:T-G:C類型堿基突變的正交轉錄突變元件。同時通過添加尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）和優化誘導條件，使突變效率提升150萬倍，而脫靶率僅增加65倍。
進一步，通過將兩種脫氨酶與噬菌體RNA聚合酶進行合理組合，研究人員構建了能夠同時引入C:G-T:A和A:T-G:C突變的雙功能正交轉錄突變元件。通過在目標基因上下游分別插入噬菌體啟動子，研究人員成功實現了突變在目標基因上的均勻分布，克服了單個啟動子策略中突變偏向啟動子近端的局限性。此外，正交性實驗結果表明，基于不同噬菌體RNA聚合酶的正交轉錄突變元件能夠特異性識別各自啟動子，避免交叉干擾，從而為之后的模塊化設計提供可能。在宿主適用性方面，該系統在非模式生物（如嗜鹽單胞菌Halomonas blue phagenesis）和模式生物（如大腸桿菌E.coli）中均表現出色，解決了現有工具在非模式生物中效率低下的難題。
在實際應用方面，該系統展現了強大的潛力。研究人員通過突變熒光蛋白和色素蛋白，成功獲得具有多種不同顏色的細胞；通過靶向突變細胞骨架和分裂相關蛋白，獲得了具有超長桿狀、球形和其他多種形狀的工程菌株，為形態學工程改造提供新的思路；在工業應用場景下，通過一輪突變進化σ70全局轉錄調控因RpoD和賴氨酸外排蛋白LysE，成功獲得能夠增強L-精氨酸耐受性和轉運能力的突變體。
正交轉錄突變系統的設計、優化與應用
綜上，正交轉錄突變系統具有高突變效率、高特異性和低脫靶率的優點，在實際進化過程中僅用一天即可完成以往需要數周才能實現的蛋白質優化過程。特別值得關注的是，該系統在模式和非模式生物中均展現出優異的性能，有效解決了現有工具在非模式工業菌株中應用受限的困境。
展望未來，該技術仍有廣闊的拓展空間和應用前景。一方面可以嘗試整合其他突變類型的脫氨酶，進一步豐富突變庫的多樣性；另一方面可以探索該系統在其他非模式生物中的兼容性和適用性。在應用層面，該突變系統可以應用于加速生物制造（如PHA生產）中關鍵酶的優化，推動綠色生物經濟發展。
清華大學生命學院教授陳國強為論文通訊作者，生命學院2022級博士生邵明威為論文第一作者。其他作者還包括陳國強實驗室科研助理張忠楠、博士后金曉帆和2023級博士生丁軍。研究得到國家自然科學基金和清華-北大生命聯合中心的支持。
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